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双顺磁标记多肽探针实现针对细胞凋亡相关蛋白酶的快速检测与分析

发布日期:2021-08-26 浏览次数:93

细胞凋亡(apoptosis)是细胞为了维持内环境稳定,适应生存环境而采取的一种自我有序性的死亡过程,该过程涉及到一系列基因的激活、表达和调控。其中,天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶(Cysteine-containing aspartate-specific protease,Caspase)家族可以启动并维持细胞凋亡过程,与细胞凋亡密切相关。该家族成员Caspase-3酶是最重要的凋亡蛋白酶之一,通常位于哺乳动物细胞凋亡通路的下游,其表达量常用于反映细胞凋亡的程度,是细胞凋亡研究的“明星分子”。

图1. Caspase介导的细胞凋亡途径

近期,中科院强磁场中心与美国伊利诺伊大学香槟分校的联合研究团队在Chemical Communications 发表了题为“Dipolar Coupling-Based Electron Paramagnetic Resonance Method for Protease Enzymatic Characterization and Inhibitor Screening”的研究论文,该论文报道了一种基于多肽探针和电子顺磁共振(Electron paramagnetic resonance, EPR)方法和Caspase 3酶检测、酶学表征、抑制剂筛选方法。

图2. 针对Caspase 3酶的双顺磁标记的多肽探针

在该报道中,研究人员设计了一个含有Caspase-3特异性识别切割序列的双顺磁标记多肽探针。该多肽探针N端通过DOTA螯合顺磁性Gd3+金属离子,C端则通过巯基连接氮氧自由基探针MTSL(图2)。由于Gd3+离子与MTSL之间因空间距离接近所产生的强偶极耦合作用,该探针的EPR谱图表现为增宽的、弱的信号,当Caspase 3对该多肽探针进行特异性切割后,Gd3+离子与MTSL之间的多肽链被切断,偶极耦合作用减弱至消失,在EPR谱图上表现为尖锐的、强的信号。通过这种EPR信号的显著变化,可用于检测Caspase 3酶的存在及活性。通过EPR实时跟踪Caspase 3切割该多肽探针的反应过程,该方法还可以进一步对Caspase 3酶的酶促反应动力学进行定量测定,获得KM、Vmax等反应动力学常数。

图3. (a)酶切前、后EPR谱图变化;(b)(c)基于该多肽探针的酶促反应动力学常数测定。

近年来,针对蛋白酶抑制剂的研究成为药物筛选、发现的重要领域,需要发展灵敏、高通量的抑制剂筛选方法。在本研究工作中,在酶活分析实验的基础上,研究人员又应用该方法探索了Caspase 3酶活相关的抑制剂、激活剂等药物的筛选实验,实验表明激活剂极大地提高了Caspase 3切割底物的效率,非特异性的抑制剂对反应的影响不大,而特异性抑制剂可以有效抑制酶切反应的发生,这与已报道的抑制剂效果相符合,也进一步证明该方法可用于蛋白酶抑制剂的筛选。

图4. 该方法应用于Caspase 3抑制剂的筛选

由于灵敏度高、无损检测等优点,EPR方法越来越多地应用于生物、化学体系中顺磁性物质的表征、测量。本研究报道了一种基于EPR技术的检测分析方法,该方法基于双顺磁中心间偶极耦合作用随空间距离变化对谱图形状、强度的影响,可以用于Caspase 3蛋白水解酶的检测、酶活测量以及抑制剂筛选。该方法可以在室温、水溶液的近生理条件环境中开展,具有检测灵敏、操作简单的优点。此外,基于多肽的探针设计使该方法具有很好的拓展性,只需要将双顺磁中心间的连接多肽段置换为其他序列,则可以用于其他水解酶、核酸酶等生物酶的检测。随着近年来单分子EPR技术、生物相容性顺磁探针技术的发展,该方法将进一步应用于活体(in vivo)细胞中蛋白酶的高灵敏度检测,以及凋亡相关药物发现的研究。

图5. 基于偶极耦合作用和EPR检测的蛋白酶检测方法

原文链接:https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2021/cc/d1cc03301h


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